3. 目的蛋白定位：

（1）細(xì)胞質(zhì)蛋白：β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、GAPDH、Vinculin、Cyclophilin B等；

（2）細(xì)胞核蛋白：PCNA、Lamin A、Lamin B、Histone H3、K70、K80、Erk2、TATA binding protein (TBP)、c-Jun、c-Fos、YY1、HDAC1等；

（3）細(xì)胞膜蛋白：Na⁺/K⁺ ATPase等；

（4）細(xì)胞質(zhì)膜蛋白：ATP1A1 (Sodium Potassium ATPase)等；

（5）線粒體蛋白：VDAC1、COXIV等；

（6）全血/血漿/血清：Transferrin、Albumin等。

4. 表達(dá)水平：

在特定實(shí)驗(yàn)條件下（如特殊的實(shí)驗(yàn)處理或不同的發(fā)育階段），內(nèi)參蛋白的表達(dá)水平相對(duì)于總蛋白需要保持恒定且高表達(dá)。常用的內(nèi)參是由管家基因表達(dá)的，是細(xì)胞發(fā)育和維持細(xì)胞活力所必須的蛋白。例如，細(xì)胞核的內(nèi)參蛋白PCNA，在DNA S期表達(dá)，因此對(duì)于非增殖細(xì)胞不推薦使用。

5. 豐度相似性：

實(shí)驗(yàn)樣本中內(nèi)參蛋白的表達(dá)豐度應(yīng)與目的蛋白的豐度有相似性，實(shí)驗(yàn)方案和檢測(cè)方法可以揭示內(nèi)參蛋白和目標(biāo)蛋白水平的變化，而不會(huì)出現(xiàn)信號(hào)飽和。如果內(nèi)參蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目的蛋白，必須對(duì)內(nèi)參蛋白進(jìn)行梯度稀釋以確定內(nèi)參蛋白的檢測(cè)范圍。

6. 表達(dá)因素：

（1）選擇蛋白表達(dá)不受實(shí)驗(yàn)變量影響的內(nèi)參，有研究表明，管家蛋白的表達(dá)有時(shí)并不恒定，會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件的改變而改變。因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案時(shí)應(yīng)該考慮實(shí)際的實(shí)驗(yàn)因素并查詢相應(yīng)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也應(yīng)該注意內(nèi)參表達(dá)是否出現(xiàn)異常。

（2）在做多組織多細(xì)胞樣本對(duì)比表達(dá)量時(shí)，最好選用GAPDH作為內(nèi)參，因?yàn)?/span>GAPDH是代謝類(lèi)蛋白，在活組織中表達(dá)比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)有差異性。

（3）在某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì)導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參。

（4）涉及細(xì)胞增殖的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，c-Jun由于自身表達(dá)變化不適合做內(nèi)參。

（5）在做凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，TBP、Lamin等不適合作為內(nèi)參。

（6）做誘導(dǎo)后樣本或檢測(cè)磷酸化等修飾性抗體時(shí)，應(yīng)選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如β-Actin和β-Tubulin。

（7）做各種分泌液樣本的時(shí)候，如血漿、乳汁、組織液等，由于沒(méi)有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參。

7. 驗(yàn)證內(nèi)參抗體質(zhì)量：

（1）陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用已知表達(dá)的樣本驗(yàn)證抗體有效性。

（2）梯度上樣驗(yàn)證：內(nèi)參條帶強(qiáng)度應(yīng)與上樣量呈線性關(guān)系。

（3）多內(nèi)參交叉驗(yàn)證：高分文章標(biāo)配，比如同時(shí)跑β-Actin和 GAPDH。

驗(yàn)證數(shù)據(jù)