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們
Western Blot技術(shù)應(yīng)用
Western Blot（WB）是全球生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)之一，WB最早是1979年由瑞士科學(xué)家Towbin報(bào)道，將SDS-PAGE電泳后的蛋白印記在NC膜上，再通過一抗和二抗標(biāo)記并顯色的方法。四十年來，隨著標(biāo)記和檢測技術(shù)的發(fā)展，WB已經(jīng)變得更加靈敏、快捷，新的抗體也使其應(yīng)用范圍更加廣泛。總結(jié)下來，WB主要可以用于以下幾個(gè)方面：
1. 定性分析——未知蛋白的鑒定；
2. 定量/半定量分析——樣本內(nèi)蛋白含量變化；
3. 蛋白構(gòu)象分析——二硫鍵、PTM及寡聚化分析；
4. 信號(hào)分析——磷酸化、泛素化等信號(hào)分子的變化；
5. 標(biāo)簽抗體的靈活運(yùn)用——蛋白研究更加方便。
本期通過實(shí)戰(zhàn)舉例為大家介紹一下Western Blot技術(shù)的應(yīng)用方向，也許你會(huì)發(fā)現(xiàn)WB還可以在您的科研工作中發(fā)揮更大的作用。
現(xiàn)有對(duì)未知蛋白定性的方法有：
氨基酸測序；
基于質(zhì)譜（MS）的肽指紋圖譜分析（電泳+MS/MS、HPLC+MS、MALDI-TOF）；
基于特異性抗體的方法（抗體芯片、WesternBlot）。
相對(duì)而言，前兩種方法耗時(shí)且對(duì)儀器設(shè)備要求高，而基于抗體的蛋白鑒定方法則比較方便快捷。
本文通過傳染性腸胃炎病毒（TGEV）感染豬睪丸細(xì)胞后的蛋白組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)23種蛋白上調(diào)，10種蛋白下調(diào)（圖A），并用WB鑒定角質(zhì)蛋白19（keratin 19）、a-微管蛋白（a- tubulin）和抗增殖蛋白（prohibitin）（圖B）參與了病毒的感染過程，表明該病毒感染與細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、囊泡運(yùn)輸及RNA處理、蛋白合成調(diào)控等有關(guān)。
WB的用途及最主要的實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪菍?duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行定量或半定量分析。
通過設(shè)置適當(dāng)內(nèi)參蛋白，將感興趣的蛋白對(duì)內(nèi)參進(jìn)行歸一化，即可比較試驗(yàn)前后樣本中某蛋白相對(duì)含量的變化，即為半定量研究。
文中利用WB對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行了半定量研究。在這篇文章中，Rijn等通過WB方法發(fā)現(xiàn)先天性腹瀉（CDD）病人及其父母DGAT1蛋白表達(dá)缺失。作者通過DNA測序分析了DGAT基因，確定了DGAT1基因五個(gè)新的純合變異體，其RT-PCR發(fā)現(xiàn)cDNA異常切割，因此DGAT蛋白無表達(dá)。這造成細(xì)胞脂代謝異常。文章通過基因敲除法構(gòu)建了DGAT1缺失型類小腸器官，還在Caco-2細(xì)胞系中重組表達(dá)了DGAT1和DGAT2，目的是體外模擬DGAT蛋白缺失及重建后對(duì)脂代謝的影響。類小腸器官及細(xì)胞系中DGAT蛋白的表達(dá)都是通過WB方法得以確定的。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除DGAT1蛋白造成脂代謝紊亂，對(duì)細(xì)胞造成脂毒性，重建DGAT1或DGAT2可恢復(fù)脂代謝。
WB用于構(gòu)象分析，主要基于其不同構(gòu)象形式時(shí)分子量所發(fā)生的變化，比如不同的寡聚、翻譯后修飾、配體結(jié)合等情況。
還原和非還原型電泳分析鏈間二硫鍵，并判斷蛋白聚合情況；
抗體表位分析法初步判斷蛋白空間結(jié)構(gòu)；
利用（N-端或C-端）抗體研究蛋白異構(gòu)體及翻譯后酶切修飾；
更重要的是，WB等方法獲得的是蛋白在寡聚、結(jié)合配體、底物、信號(hào)標(biāo)簽等生理?xiàng)l件下，其分子量的動(dòng)態(tài)變化，從而將蛋白結(jié)構(gòu)研究與功能研究有機(jī)結(jié)合。
案例Ⅰ
泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)于錯(cuò)誤蛋白降解具有重要意義。左圖顯示Nrf2蛋白在泛素連接酶作用時(shí)間延長后，泛素化程度逐漸增加。若將各時(shí)間點(diǎn)的Nrf2蛋白結(jié)構(gòu)解析，即可將該蛋白的結(jié)構(gòu)研究與功能研究相結(jié)合。在Virology的這篇文獻(xiàn)中，作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132和lactacystin可顯著降低豬II型圓環(huán)病毒（PCV2）早期感染的滴度，并通過對(duì)泛素基因的沉默實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其也顯著降低PCV2滴度，由此推斷泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是PCV2的早期復(fù)制所必須的。
案例Ⅱ
硝基化促使a-突觸核蛋白（a-synuclein）寡聚，以及寡聚化的a-synuclein促使人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SH-SY5Y凋亡，并呈時(shí)間劑量效應(yīng)的研究。WB結(jié)果顯示硝基化程度加深，a-synuclein呈現(xiàn)了二聚及多聚特性。硝基化的a-synuclein激活了iNOS并抑制了FAK，這兩條信號(hào)可能都參與了促SH-SY5Y凋亡作用。作者還發(fā)現(xiàn)integrin抗體部分抑制了細(xì)胞凋亡，將已有的integrin/FAK/caspase 3信號(hào)通路改變?yōu)閕ntegrin-iNOS/-FAK/caspase 3信號(hào)通路。
磷酸化是細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)方式，特異的磷酸化抗體可以用于：
分析信號(hào)分子磷酸化水平，從而與其功能研究建立聯(lián)系；
分析不同磷酸化位點(diǎn)對(duì)于信號(hào)分子功能的影響，比如p53總磷酸化水平與不同位點(diǎn)磷酸化水平對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，以及與癌癥發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系。
案例Ⅰ
Cai等在JBC上發(fā)表的文章，揭示了微小RNA在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA miR-17/20a靶向抑制p53的核心激酶DAPK3（死亡相關(guān)蛋白激酶3）的表達(dá)，去除這些微小RNA將導(dǎo)致依賴于p53的微小RNA轉(zhuǎn)錄抑制被去除，從而形成一個(gè)正反饋環(huán)，促進(jìn)腫瘤形成，它們被稱為原癌微小RNA（oncomiRs）。C圖清楚顯示了當(dāng)對(duì)Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)入miR-17、miR-20a或miR-17/20a拮抗劑后，DAPK3蛋白表達(dá)增加，雙鏈DNA不穩(wěn)定性的標(biāo)志物ATM（Ser-1981）、p53BP1（Ser-25/29）蛋白絲氨酸磷酸化程度增高，而各自總蛋白水平并沒有變化。D圖進(jìn)一步確認(rèn)了這些磷酸化水平升高是由DAPK3表達(dá)量升高引起的。p53磷酸化水平升高將導(dǎo)致其抑制原癌微小RNA轉(zhuǎn)錄的水平下降，進(jìn)一步提高DAPK3激酶的表達(dá)。該研究補(bǔ)充了原有的通過E2F家族蛋白激活miR-17/20a的負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路。
案例Ⅱ
糖尿病代謝紊亂可能會(huì)增加阿爾茨海默癥（AD?。╋L(fēng)險(xiǎn)，其病理機(jī)制是導(dǎo)致Ab和tau蛋白表達(dá)量的增加。在Clin Interv Aging雜志的文章中，作者發(fā)現(xiàn)四環(huán)素衍生藥物二甲胺四環(huán)素可降低糖尿病模型大鼠的Ab蛋白表達(dá)，tau蛋白磷酸化及炎癥因子如IL-1b等的表達(dá)。證實(shí)該藥物是通過抑制糖尿病代謝紊亂所引起的炎癥反應(yīng)而淀粉樣前體的形成。WB結(jié)果顯示，藥物處理前后總tau蛋白并無變化，但神經(jīng)元內(nèi)斑塊標(biāo)志物T231和S214磷酸化tau的磷酸化程度明顯降低，胞間斑塊標(biāo)志物PHD指形蛋白1（PHF-1）的磷酸化也明顯降低。
生物學(xué)研究已開發(fā)出許多標(biāo)簽蛋白，如FLAG、His、GST、c-Myc、SUMO、GFP熒光蛋白等，它們極大地方便了蛋白的表達(dá)、純化、示蹤及定性、定量的多項(xiàng)研究。利用標(biāo)簽抗體的優(yōu)勢有：
同一標(biāo)簽抗體研究不同的融合蛋白；
融合蛋白可用anti-靶點(diǎn)抗體和anti-標(biāo)簽抗體雙重鑒定；
GFP標(biāo)簽即可用于IF/ICC檢測，又可用于WB等檢測；
標(biāo)簽（如FLAG、HA）抗體用于融合蛋白的IP或co-IP較ProA/G偶聯(lián)方便快捷。
標(biāo)簽抗體常用于Western Blot實(shí)驗(yàn)中：
重組或敲除細(xì)胞系的鑒定；
融合蛋白表達(dá)量的差異；
在目標(biāo)蛋白的不同位置加標(biāo)簽，再通過相應(yīng)的標(biāo)簽抗體檢測來實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白功能區(qū)的劃分和鑒定。
案例Ⅰ
Radics等在脂膜上設(shè)計(jì)了精巧的針形通道，模擬在細(xì)菌膜上的3型分泌系統(tǒng)（注射體，"injectisomes"），研究注射體的結(jié)構(gòu)及工作原理。作者通過設(shè)計(jì)目標(biāo)蛋白SptP(WT)及其FLAG和GFP標(biāo)簽融合蛋白，F(xiàn)LAG標(biāo)簽可用于示蹤蛋白在胞內(nèi)和胞外的分布。由于帶有GFP標(biāo)簽的融合蛋白不能通過該通道，GFP標(biāo)簽起到了使SptP形成蛋白-通道復(fù)合體的作用，可用冷凍電鏡解析復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。利用金標(biāo)抗GFP抗體可在電鏡下顯示復(fù)合體的形成。
案例Ⅱ
本文利用標(biāo)簽蛋白研究蛋白的功能區(qū)。Yang等在研究單純皰疹病毒（HSV）出芽復(fù)合體的形成機(jī)制時(shí)，設(shè)想病毒蛋白pUL31的C端25個(gè)Aa對(duì)于其結(jié)合衣殼蛋白及核蛋白形成核出芽復(fù)合體（NEC）非常重要，于是設(shè)計(jì)帶有HA標(biāo)簽的pUL31蛋白31HA，缺少C端25個(gè)Aa的31HA/560S，以及缺少pUL25區(qū)的31HA/25 null，發(fā)現(xiàn)pUL31及缺少pUL25的pUL31可以結(jié)合衣殼蛋白，但缺少C端25個(gè)Aa的31HA/560S不能結(jié)合。利用金標(biāo)記HA抗體可在電鏡下觀察到衣殼蛋白頂端與pUL31形成復(fù)合體的情形。
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